人轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β，TransformingGrowthFactorBeta）是一種具有多種生物學(xué)功能的細胞因子，參與細胞生長、分化、免疫調(diào)節(jié)等過程。TGF-β的異常表達與多種疾病（如癌癥、心血管疾病、纖維化等）密切相關(guān)。因此，TGF-β的檢測對相關(guān)疾病的研究和診斷非常重要。
人轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）檢測試劑盒通常基于酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）原理，以下是常見的ELISA法檢測人TGF-β的步驟：
一、試劑盒內(nèi)容
包被抗體：用于捕捉TGF-β蛋白。
標準品：已知濃度的TGF-β標準樣本，用于繪制標準曲線。
二抗：與TGF-β結(jié)合的二抗，通常會與酶標記物（如HRP或AP）結(jié)合。
底物溶液：用于酶催化反應(yīng)生成顏色變化，便于定量。
洗滌緩沖液：用于清除試管內(nèi)多余的物質(zhì)。
封閉液：用于封閉反應(yīng)板孔內(nèi)非特異性結(jié)合位點，減少背景干擾。
二、檢測步驟
1.樣品制備
血清或血漿樣品：將血液樣品收集后，經(jīng)過離心（通常3000rpm，10分鐘），取上清液（血清或血漿）。
細胞培養(yǎng)上清液：從培養(yǎng)的細胞中收集培養(yǎng)上清液，進行相應(yīng)的稀釋。
組織提取液：如需從組織樣品中提取TGF-β，使用適當?shù)牧呀庖哼M行組織均質(zhì)化，離心后取上清液。
2.加樣與孵育
向96孔板中每個孔內(nèi)加入100μL標準品、樣品或空白對照液。
使用封板膜封住孔板，輕輕搖晃，使樣品與孔壁上的包被抗體充分結(jié)合。
按照試劑盒說明書，通常需要在37°C孵育1-2小時。
3.洗滌
孵育完成后，使用洗滌緩沖液（通常是PBS或TBS緩沖液）將孔板清洗3-4次，以去除未結(jié)合的物質(zhì)。
每次清洗后需要振動或搖晃孔板，確保洗滌均勻。
4.加入二抗
向每孔加入100μL二抗溶液（通常是帶有酶標記的二抗），并在37°C孵育1小時，確保二抗與TGF-β結(jié)合。
5.再次洗滌
孵育后，再次清洗孔板，去除未結(jié)合的二抗。
6.加入底物溶液
向每孔加入100μL底物溶液，通常采用TMB底物。酶標記二抗催化底物后，反應(yīng)產(chǎn)生藍色產(chǎn)物。
在暗處孵育5-30分鐘，觀察顏色變化。
7.停止反應(yīng)
當反應(yīng)達到所需的顏色深度時，加入停止液（通常是硫酸或其它酸液）終止反應(yīng)，底物會變?yōu)辄S色。
8.檢測吸光度（OD值）
使用酶標儀（通常設(shè)置在450nm波長）讀取各孔的吸光度值（OD值）。
三、數(shù)據(jù)分析
標準曲線的繪制
根據(jù)標準品的已知濃度和對應(yīng)的吸光度（OD值）繪制標準曲線，標準品的濃度通常采用對數(shù)濃度進行設(shè)置。
樣品濃度的計算
根據(jù)樣品的吸光度（OD值）與標準曲線進行比對，計算樣品中TGF-β的濃度。結(jié)果一般以pg/mL或者ng/mL為單位。
質(zhì)量控制
對于每次實驗，需要使用空白對照（無樣品）、低濃度對照（低TGF-β濃度）和高濃度對照進行驗證，確保實驗的準確性。
四、注意事項
樣品的處理：血清或血漿樣本要盡量避免反復(fù)凍融，因為反復(fù)凍融可能影響TGF-β的活性。樣品應(yīng)盡快檢測，若需要長期保存應(yīng)低溫冷凍（-80℃）。
實驗環(huán)境控制：整個實驗過程中，溫度、孵育時間及底物反應(yīng)時間需要嚴格控制，避免誤差。
反應(yīng)終止時間：底物反應(yīng)結(jié)束后盡快加入停止液，防止顏色變化過快影響測量。
清洗步驟：洗滌不徹底會導(dǎo)致非特異性結(jié)合，增加背景干擾，影響結(jié)果的準確性。
五、常見問題和解決方案
信號背景過高
可能是洗滌不充分或二抗與樣品結(jié)合過強，檢查洗滌步驟并控制孵育時間。
標準曲線不線性
可能是樣品濃度超出了檢測范圍，或者標準品的稀釋不當。嘗試調(diào)整樣品稀釋度，確保處于標準曲線的線性范圍內(nèi)。
吸光度過高或過低
可能是底物反應(yīng)時間過長或過短，調(diào)整底物孵育時間。
